Nous avons le plaisir de publier ici , avec l'accord de VDH , un filleul parrainé par l'une des donatrices de VNED , un rapport de recherche qu'il a réalisé dans le cadre de ses études universitaires " Recherche sur la propriete anti bacterienne contre le listeria innocua lrgia01 de l’huile essentielle de cannelle " . La traduction en Français de ce rapport a été assurée par M. Vinh Phong ( délégation VNED de l'Isère ) dont nous remercions pour se contribution .

RECHERCHE SUR LA PROPRIETE ANTI BACTERIENNE CONTRE LE LISTERIA INNOCUA LRGIA01
DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CANNELLE

Lê Thanh Mai 1, Nguyễn Thị Bình 1, Vũ Đình Huyên1, Trịnh Thị Thanh Nga1,2, Nadia Oulahal2
1 Institut des Technologies Biologiques et Alimentaires. Ecole Polytechnique de Hanoi
2Laboratoire BioDyMIA, Université Lyon 1, République Française

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        Réceptionné à la rédaction en 09/2014

            RESUME
La cannelle est abondante au Vietnam; son huile essentielle, d’après plusieurs études, a une bonne propriété anti bactérienne. Dans cette étude, nous avons évalué sa propriété anti Listeria Innocua LRGIA01(L. innocua) dans le milieu Tryptone Soy Broth (TSB). Les résultats obtenus montrent que dans ce milieu, l’huile essentielle de cannelle, aux concentrations respectives MIC et MBC de 350 µg/mL et 3000 µg/mL,   a la propriété de contrôler le développement de  L. innocua. La propriété anti L. innocua dépend de plusieurs facteurs tels que : concentration de l’huile essentielle de cannelle, densité des bactéries, durée d’exposition, température et quantité d’air admise.
Mots Clés bibliographiques : huile essentielle de cannelle, propriété anti bactérienne, Listeria innocua, MIC, MBC

            1.  INTRODUCTION
L’hygiène assurant la sécurité  et la conservation des produits alimentaires est un des besoins importants et nécessaires de la vie moderne. De nos jours, il existe plusieurs méthodes de conservation alimentaire pour limiter la contamination des produits alimentaires par les microbes comme l’utilisation des produits chimiques, de la température…Cependant, inhérents à ces méthodes, plusieurs problèmes se posent : influence sur la santé des consommateurs, réduction de la qualité des produits alimentaires. Aussi l’utilisation de l’huile essentielle de cannelle comme conservateur biologique est-elle un bon choix ;  elle a donc attiré l’attention de plusieurs chercheurs.
L’huile essentielle est un mélange de composants légers, volatils, parfumés, bien influencés par la chaleur, la lumière, l’air[1]. Depuis longtemps l’huile essentielle de cannelle a été largement utilisée dans l’industrie pharmaceutique, dans l’industrie agroalimentaire, dans la parfumerie et dans les cosmétiques…[2]. Actuellement, le potentiel d’exploitation des huiles essentielles en général et de l’huile essentielle de cannelle en particulier  est très grand au Vietnam. L’huile essentielle de cannelle est normalement extraite des feuilles, de l’écorce du cannelier par l’intermédiaire de la vapeur d’eau, par fractionnement [1].  Comme toutes les huiles essentielles, l’huile essentielle de cannelle est un anti oxydant puissant, l’huile essentielle possède un certain nombre de composants possédant des propriétés particulières comme anesthésiant, facilitateur de digestion, attirant d’insectes. En particulier, elle est anti bactérienne, anti mycosique, anti virale, anti cancer, bactéricide, fongicide [3,4,5]. Le principal composant chimique (90%) de l’huile essentielle de cannelle est le transcinnamaldehyde [6].
Dans cette étude , nous avons évalué la propriété anti Listeria innocua LRGIA01 (L.innocia) de l’huile essentielle de cannelle dans le milieu TSB et évalué les influences de quelques facteurs comme la concentration de l’huile essentielle, la densité des bactéries, la durée d’exposition, la température et la quantité d’air admis.

2.  MATERIAUX ET METHODES D’ANALYSE
2.1  Matériaux analysés
2.1.1  Huile essentielle de cannelle
 Elle est achetée à  l’Institut de Chimie des Produits Naturels (Académie des Sciences et Technologies du Vietnam) ; cette huile essentielle est produite par distillation  des matériaux d’origine récoltés au Vietnam.
 2.1.2  Echantillon de bactérie, bouillon et conditions de culture :
 Le Listeria innocua LRGIA01 est fourni par le laboratoire BioDyMIA (Université Lyon 1, France). L’échantillon est conservé à -20°C en milieu TSB 3% (w/w) (Biokar, Beauvais, France) avec du glycérol à 15%(v/v). Pour le réactiver, mélanger 1mL de solution source à 9mL de solution TSB, maintenir à 30°C pendant 8h ; après cette étape mettre 5mL  de la solution obtenue  dans 45mL TSB et maintenir  à 30°C toute le nuit.

2.2     Méthodes d’analyse
2.2.1      Détermination de la densité des bactéries par la méthode de comptage en solution diluée [7]
2.2.2      Détermination  des concentrations MIC et MBC
La détermination de MIC et MBC se fait en diluant progressivement la solution [6]. La valeur MIC est celle minimale à partir de laquelle le développement des bactéries est inhibé complètement après 24 h de culture (après 24h la densité bactérienne est plus faible qu'à l’instant 0h). La valeur MBC correspond à la concentration minimale à partir de laquelle aucune trace de bactérie vivante n’est  trouvée sur support solide après 24h de culture.   
Préparer la solution source de l’huile essentielle de cannelle à la concentration de 10 000 µg/mL puis la diluer en milieu TSB jusqu 'à la concentration voulue (de 100 à 5 000 µg/mL). Après réactivation, mettre les différents échantillons de culture bactérienne (normalement la densité bactérienne dans l’échantillon est de 108 - 109 ) dans les différentes solutions diluées d’huile essentielle pour obtenir la densité finale des bactéries de 103 CFU/mL et jusqu'au volume final de 1mL. Bien remuer la solution au moyen de l’appareil vortex ; mettre en culture à 30°C ; compter les bactéries après 24h puis comparer au nombre de bactéries de l’échantillon à l’instant 0h .

        3. RESULTATS et DISCUSSION
3.1    Déterminer la propriété anti Listeria innocua LRGIA01 en milieu TSB
L’échantillon de Listeria innocua est dilué à la densité 103 CFU/mL et cultivé en milieu TSB 3% contenant des concentrations respectives d’huile essentielle variant de 100 à 5 000 µg/mL pour déterminer les valeurs MIC et MBC. Les résultats affichés dans le tableau 3.1 donnent les valeurs respectives de MIC et de MBC : 350 et 3 000  µg/mL ; elles sont   du même ordre de grandeur que celles des  résultats de [6].
Tableau 3.1 : propriété inhibitrice et bactericide contre Listeria innocua de l’huile essentielle de cannelle
Milieu     Concentration minimale
 inhibitrice MIC( g/mL)
Concentration minimale
 bactéricide MBC ( g/mL)

TSB    350    3000

3.2    Influences de certains paramètres sur cette propriété anti Listeria innocua de l’huile essentielle de cannelle en milieu TSB
3.2.1    Influence de la concentration de l’huile essentielle de cannelle
Pour déterminer l’influence des différentes concentrations (de 0à 4 000 µg/mL) de l’huile essentielle de cannelle, nous avons suivi le développement de la densité bactérienne en milieu TSB aux instants 0h, après 3 minutes d’agitation au vortex et après 24h de culture ( tableau 3.2).  A l’instant 0h, la densité bactérienne injectée dans les échantillons est la même (2.103 CFU/mL), après seulement 3 minutes d’agitation par vortex, le nombre de bactéries survivantes est déjà réduit presque autant que dans l’échantillon après 24 h de culture. Ceci prouve que la propriété anti bactérienne est immédiate ; plus la concentration de l’huile essentielle est grande plus l’action anti bactérienne est efficace.

Tableau 3.2 : Influence de la concentration de l’huile essentielle de cannelle sur
la propriété anti Listeria innocua
Durée de culture    Densité des bactéries  L. innocua (CFU/mL)
    Concentration de l’huile essentielle de cannelle ( g/mL)

    0    350    500    1000    2000    3000    4000
0    2.103    2.103    2.103    2.103    2.103    2.103    2.103
 3  mn     2.103    1,6.103    1,5.103    1,2.103    0,8.103    0,2.103    0,2.103
24 h     109    1,13.103    1,05.103    1.103    0,5.103    0    0


3.2.2     Influence de la durée d’exposition sur la propriété anti bactérienne
Toutes les 3h les échantillons de culture de L.innocua sont sortis pour le comptage des bactéries survivantes (figure 3.1). Sans huile essentielle, le nombre de bactéries augmente vigoureusement de 3log à 9log. En ajoutant l’huile essentielle de cannelle à la  concentration variant de 350 à 2 000 µg/mL, le nombre de bactéries ne change pas ou a tendance à baisser très légèrement après 28h de culture. A la concentration de 3 000 µg/mL, après 9h,  90% des bactéries sont tuées ; après 24 h , elles sont complètement anéanties. Une concentration de 3 500 µg/mL suffit pour anéantir complètement les bactéries au bout de 6h.
 
Figure 3.1 Influence de la durée et de la concentration sur la propriété anti L.innocua

3.2.3     Influence de la densité bacterienne sur la propriété anti  L.innocua de l’huile essentielle de cannelle
Le nombre de bactéries survivantes après 24h de culture des 3 densités bactériennes différentes, 102,  103 et 10  4 CFU/mL (figure 3.2) est compté. Plus la densité bactérienne est forte, plus MIC et MBC augmentent. Les MBC correspondantes aux densités initiales de 102,  103 et 10  4 CFU/mL sont respectivement 2 000 µg/mL, 3 000 µg/mL, et   > 3500 µg/mL. Ainsi plus le nombre de bactéries est faible , plus la quantité d’huile essentielle agissant sur chaque bactérie est  importante; par conséquent la propriété inhibitrice et bactéricide augmente.
 
Figure 3.2 influence de la densité  bactérienne L.innocua sur la propriété anti bactérienne de l’huile essentielle de cannelle

3.2.4     Influence de la température et de l’air sur la propriété anti bactérienne de l’huile essentielle de cannelle
Le comptage des bactéries survivantes a été effectué sur des échantillons cultivés pendant 24h aux 3 températures
4°C( dans le réfrigérateur), 30°C et  37°C(dans l’étuve) ; et soumis aux 2 conditions avec et sans agitation (figure 3.3)
 
Figure 3.3 : Influence de la température et de la quantité d’air admise sur la propriété anti L.innocua de l’huile essentielle de cannelle
Les résultats montrent que la température est un facteur important de la propriété anti bactériennen de l’huile essentielle de cannelle.
A 4°C, en milieu TSB, sans huile essentielle, la densité bactérienne a augmenté mais de façon négligeable, de 103 à 3.2 103 CFU/mL ; en présence de l’huile essentielle, la plus faible concentration où toutes les bactéries ont été tuées est de de 350 µg/mL. La basse température a augmenté la propriété anti bactérienne de l’huile essentielle de cannelle.
 Il n’y a pas beaucoup de différence entre les conditions de 30°C et 37°C avec agitation. Cependant , à 37°C, le nombre de bactéries survivantes est plus faible avec agitation que sans agitation. Il se peut que l’agitation de la solution contribue à stimuler l’interaction de l’huile essentielle sur  les bactéries qui finissent par être tuées plus facilement.


                4.  CONCLUSION

Dans le milieu TSB l’huile essentielle de cannelle a la propriété inhibitrice contre L.innocua au MIC=350 µg/mL et bactéricide contre L.innocua  au MBC= 3000 g/mL. Cette propriété anti bactérienne est presque immédiate ;  car seulement après 3 minutes d’agitation par le vortex, la proportion des bactéries ayant survécu est proche de celle résultant de 24h de culture. Plus la concentration de l’huile essentielle est importante plus la durée nécessaire pour éliminer L.innocua est faible, à la concentration 3000 g/mL il faut 24h, mais à la concentration  3500 g/mL, 6h suffisent pour éliminer complètement toutes les bactéries. Plus la densité bactérienne est faible plus la concentration d’huile essentielle requise peut être réduite. La basse température augmente la propriété anti bactérienne de l’huile essentielle de cannelle ; avec agitation,  cette tendance est plus nette que sans agitation.


                5.  DOCUMENTS CONSULTES

1.    Evans W.C. Trease and Evan’s Pharmacognosy, 14th edition SANDERS, (1998) 48-65, 612
2.    Sara, B.Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in food-a review. Int J Food Microbiol 94 (2004) 223-253.
3.    Chang,S.-T., P.-F. Chen and S.-C. Chang. Antibacterial activity of leaf essential oils and their constituents from cinnamomum osmophloeum. Journal of Ethnopharmacology 77(2001) 123-127.
4.    Yang,C.-H., C.-S. Yang, M.-L. Hwang, C.-C. Chang, R.-X. Li and L.-Y. Chuang.
    Antimicrobial activity of various parts of cinnamomum cassia extracted with different extraction methods . Journal of Food Biochemistry 36(2012) 690-698.
5.    Shan, B., Y.-Z. Cai, J. D. Brooks, and H. Corke. Antibacterial properties and major bioactive components of cinnamon stick (Cinnamomum burmannii): activity against foodborne pathogenic bacteria. J. Agric. Food Chem. 55 (2007) 54- 84.
6.    Nga Trinh Thi Thanh, E. D., Adem Gharsallaoui, Mai Huong Ly – Chatain Gouin, Khalid Bensadi, Pascal Degraeve, Mai Le Thanh, Nadia Oulahal. Study of the antimicrobial efect of esential oils from Vietnam to assess their potential application to food preservation. Tạp chí Khoa học và Công nghệ,  51(6a), (2013) 346 – 352.
7.    Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền , Phạm Thu Thủy , Nguyễn Thanh Hằng, Lê Lan Chi. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật 2007, tr.235

ABSTRACT
STUDY OF THE ANTIMICROBIAL EFFECT OF CINNAMON ESSENTIAL OILS
AGAINST LISTERIA INNOCUA LRGIAO1

Le Thanh Mai1, Nguyen Thi Binh1, Vu Đinh Huyen1, Trinh Thi Thanh Nga1,2 , Nadia Oulahal2
1 School of Biotechnology and Food Technology, Hanoi University of Science and Technology,
2University of Lyon, BioDyMIA (Bioengineering and Microbial Dynamics in Foods Interfaces)
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Vietnam is a country having abundant resources of cinnamon. Vietnamese Cinnamon essential oil has been reported with high antimicrobial activities in numerous studies.  . In this study, the antibacterial activity of Vietnamese Cinnamon essential oils against Listeria innocua LRGIA01 (L. innocua) was investigated in a synthetic medium Tryptone Soy Broth (TSB). The result showed that in this medium,  the Vietnamese Cinnamon essential oil inhibited L. innocua TSB at  MIC and MBC values corresponding to 350µg/mL and 3000µg/mL, repectively. The inhibition activity of Cinnamon essential against L. innocua was affected by a number of factors such as: Cinnamon essential oil concentration, bacteria density, incubation time, temperature and aeration condition.
Keywords: Cinnamon essential oil, antibacterial activity, Listeria innocua , MIC, MBC .

Vinh Phong ( Traducteur )

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